MilliporeECL發(fā)光液比DAB顯色靈敏度高千倍以上。在暗房?jī)?nèi)高豐度蛋白條帶的熒光常常數(shù)小時(shí)內(nèi)仍然肉眼可見(jiàn)，X線膠片曝光5～30s即可得到高清晰條帶；低豐度蛋白條帶熒光肉眼可能不易察覺(jué)，但曝光30s~5min即可檢測(cè)條帶；極低豐度的蛋白條帶熒光可允許30min~12h曝光以檢測(cè)目的條帶。MilliporeECL發(fā)光液衰減較慢，20min內(nèi)熒光幾無(wú)減弱，檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生的非特異背景非常低，也可節(jié)省抗體和待測(cè)樣品的用量
 

　　1.保鮮膜的質(zhì)量。a.國(guó)產(chǎn)的保鮮膜，很多廠家偷工減料打價(jià)格戰(zhàn)，造成保鮮膜很薄亦破損。ECL滴加到保鮮膜上容易從肉眼不易分辯的小孔泄露，一方面ECL反應(yīng)不充分，另一方面ECL所含液體會(huì)溶解試驗(yàn)臺(tái)上殘留未知的化學(xué)藥品顆粒(也許你或其他人曾經(jīng)不小心打翻過(guò)某種化合物)、灰塵等等，造成熒光淬滅。在簡(jiǎn)述原理時(shí)，我曾經(jīng)提到過(guò)很多化合物、金屬離子能直接催化過(guò)氧化物水解，在極短的時(shí)間內(nèi)消耗掉所有的HRP酶，熒光轉(zhuǎn)瞬即逝。
 

　　b.保鮮膜的化工原料或拉制過(guò)程中，殘留未知的化學(xué)試劑，引起熒光淬滅；廉價(jià)的保鮮膜問(wèn)題尤多。
 

　　目前，國(guó)產(chǎn)的就“妙潔”比較過(guò)關(guān)，保鮮膜厚度和化學(xué)物殘留都不影響ECL顯影。
 

　　如果買不到合格的保鮮膜，也可以用其他物品替代；但要特別注意這些支持物表面的干凈，好不要有任何化學(xué)試劑殘留，包括風(fēng)干的TBST鹽結(jié)晶顆粒。
 

　　2.ECL孵育結(jié)束后膜需要控干。中學(xué)物理學(xué)過(guò)水會(huì)吸收光譜，因此任何液體包括ECL溶液本身都會(huì)干擾熒光強(qiáng)度，所以ECL孵育結(jié)束時(shí)需要控干。一般夾起膜，讓膜的一角或一邊接觸吸水紙；但是請(qǐng)注意不能讓膜干掉。某些信號(hào)較弱的ECL，膜干掉后熒光會(huì)消失；較好的試劑盒，熒光相對(duì)穩(wěn)定，但吸干以后，背景熒光也會(huì)升高，而且會(huì)嚴(yán)重影響重新標(biāo)記新抗體時(shí)的背景。因此，按照我的方法，讓自由流下的多余的ECL被吸走就好。
 

　　3.控干的膜要仔細(xì)用保鮮膜包被，防止接觸外界異物造成熒光淬滅；同時(shí)，包裹保鮮膜時(shí)要細(xì)心，盡量不讓正面保鮮膜和膜之間出現(xiàn)皺褶。皺褶的地方會(huì)堆積多余的ECL，要么形成一條熒光的亮線；要么由于液體吸收熒光或者局部區(qū)域HRP過(guò)度消耗，呈線條狀淬滅。
 

　　4.在膜放入壓片夾之前，好肉眼觀察一下熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，這有利于判斷實(shí)驗(yàn)可能出現(xiàn)的問(wèn)題。很多人提問(wèn)看見(jiàn)很強(qiáng)的熒光了，但怎么壓片都沒(méi)有信號(hào)，那么就是快速淬滅(閃滅，再怎么快速操作也拿不到這種情況下的熒光信號(hào))造成的；有這個(gè)觀察至少能夠判斷ECL孵育之前實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)該問(wèn)題不大，而問(wèn)題主要是淬滅。如果你省略這個(gè)步驟，那問(wèn)題就非常復(fù)雜了，因?yàn)橹叭魏尾僮鞫伎赡軐?dǎo)致白板，根本無(wú)法判斷。